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Pubblicato da il 3 Feb, 2019 in Biochimica

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Anticorpi (Immunoglobuline)

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Le immunoglobuline (chiamate anche anticorpi) si collocano nell’ambito della risposta immunitaria, quella linea di difesa che l’organismo mette in atto per arginare l’invasione di sostanze estranee come proteine esogene, virus e batteri.

 

Indice:


Cenni di Immunologia


La risposta immunitaria viene prodotta da due sistemi complementari: i sistemi immunitari cellulare e umorale.

L’immunità cellulare (o cellulo-mediata) viene esercitata essenzialmente dai linfociti T, che in alcuni casi attivano i fagociti e in altri uccidono qualsiasi tipo di cellula in cui sono presenti agenti infettivi. Essi agiscono sugli agenti infettivi intracellulari attraverso il riconoscimento di molecole proteiche.

L’immunità umorale viene esercitata dalle immunoglobuline (abbreviate Ig), le quali sono proteine prodotte dai linfociti B e rilasciate nel sangue e nelle secrezioni delle mucose, dove neutralizzano ed eliminano microbi e tossine. Gli anticorpi agiscono unicamente verso agenti infettivi extracellulari, riconoscendo diversi tipi di molecole tra cui proteine, lipidi e carboidrati. Sono inefficaci, invece, nei confronti di quelli che vivono e si replicano all’interno delle cellule infettate.

 

Concetti Fondamentali


Alcune proprietà delle interazioni tra le immunoglobuline e le molecole che esse vanno a legare sono caratteristiche del sistema immunitario e per descriverle vengono usati termini specifici; introduciamo quindi alcuni concetti fondamentali.

Qualsiasi molecola (agente patogeno) in grado di indurre una risposta immunitaria viene detta antigene. Un antigene può essere un virus, una parete cellulare batterica, una proteina o un’altra macromolecola.

Un singolo anticorpo – essendo estremamente specifico – riconosce solo una particolare struttura all’interno dell’antigene, che viene detta determinante antigenico o epitopo. Degli epitopi può essere riconosciuta la sequenza amminoacidica (epitopi lineari) oppure la forma (epitopi conformazionali).

Riassumendo, un unico antigene innesca la produzione di numerosi anticorpi, ciascuno dei quali lega specificamente un solo epitopo, o al massimo pochi epitopi aventi caratteristiche strutturali molto simili. La forza con cui un anticorpo si lega a un dato epitopo viene detta affinità1 dell’interazione, e viene solitamente espressa in termini di costante di dissociazione (Kd).

Le molecole più piccole (Mr < 5000, solitamente intermedi comuni o prodotti del metabolismo cellulare) sono incapaci di indurre una risposta immunitaria, ma se legate covalentemente a una molecola (carrier) possono evocare la produzione di un anticorpo. Tali piccole molecole vengono definite apteni. Una volta che l’immunoglobulina si è formata, l’aptene mantiene la capacità di legarvisi anche se slegato dal carrier.

 

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Struttura delle Immunoglobuline


Il monomero di un’immunoglobulina è una molecola formata da 4 catene polipeptidiche, 2 leggere (L) e 2 pesanti (H). Tali catene sono legate da ponti disolfuro a formare una Y: i ponti associano una catena leggera a una pesante e le due catene pesanti fra di loro.

Dove inizia la divaricazione della Y sono presenti due zone definite “cerniere”, qui la proteina può essere scissa usando papaina o pepsina (idrolisi). Dalla digestione con queste proteasi vengono liberati un frammento basale, facilmente cristallizzabile e per questo definito Fc, e 2 frammenti contenenti una porzione che lega l’antigene, definiti Fab (antigen binding). Il frammento Fc risulta costituito dalla metà carbossiterminale di entrambe le catene H, mentre i frammenti Fab contengono ciascuno la metà amminoterminale di una catena H e un’intera catena L.

La struttura fondamentale delle Ig è il dominio globulinico2: ogni catena leggera presenta un dominio globulinico variabile, indicato con (V), e un dominio costante (C). Nelle catene pesanti sono individuabili invece un dominio V e 3 o 4 domini C. I domini variabili si associano per formare il sito che lega l’antigene.

Ciascun dominio è costituito da due strati di foglietti β legati da un ponte disolfuro, le estremità dei foglietti β vengono connesse da corte anse protrudenti che costituiscono le porzioni del recettore che legano l’antigene. Tali regioni vengono chiamate “CDR” (Complementary Determining Region) o ipervariabili, perché in queste brevi sequenze si concentrano le variazioni che permettono di distinguere gli antigeni.

Va ricordato che i domini Ig sono presenti non solo negli anticorpi, ma in molte altre proteine anche non appartenenti al sistema immunitario. Si ritiene che tutte queste proteine si possano essere evolute a partire da un gene comune ancestrale, e si classificano di conseguenza come appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline.

In un anticorpo il sito di legame dell’antigene è composto dalla regione V della catena pesante (VH) e dalla regione V della catena leggera (VL). Ogni Ig presenta due siti di legame per l’antigene identici fra loro; la regione cerniera compresa fra i frammenti Fab e Fc consente alle regioni Fab di muoversi indipendentemente e, quindi, di legare contemporaneamente epitopi antigenici più o meno distanti fra loro.

Le regioni VH e VL presentano ciascuna 3 regioni ipervariabili (o CDR). Di queste la più variabile è CDR3, posizionata alla giunzione tra le regioni V e C. CDR3 è la parte che contribuisce maggiormente al legame con l’antigene, perché essendo la più variabile è anche la più specifica.

 

Classificazione delle Immunoglobuline


Sulla base delle regioni C delle catene pesanti è possibile suddividere le immunoglobuline in 5 classi: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.

Le classi degli anticorpi prendono il nome dalle lettere greche con cui vengono indicate le diverse catene pesanti: αδεγμ.

Le catene leggere si distinguono in catene κλ, presenti in tutte le classi di immunoglobuline. Ciascun linfocita B esprime una delle due, ma mai entrambe.

Le IgG sono gli anticorpi più abbondanti nel sangue in quanto anticorpi principali della risposta immunitaria secondaria. Hanno una struttura monomerica che ricalca quella generale spiegata in precedenza.

Le IgD e le IgE hanno una struttura monomerica, simile a quella delle IgG. La funzione specifica delle IgD non è ancora stata chiarita, tuttavia assieme alle IgM sono gli anticorpi presenti sulla membrana dei linfociti B naïve, che non hanno ancora incontrato un antigene (ogni anticorpo produce una sola sola delle due, in seguito all’esposizione con l’antigene alcuni anticorpi continuano a produrre IgM mentre altri produrranno Ig di classi differenti).

Le IgE vengono secrete soprattutto nei tratti respiratorio e digerente, mediano la risposta allergica e costituiscono una linea di difesa contro i parassiti elmintici.

Le IgA possono essere monomeriche, dimeriche o trimeriche. Si trovano libere nelle secrezioni come la saliva, le lacrime e il latte. Presentano una catena J di collegamento (joining) e un componente secretorio.

Le IgM possono avere una struttura monomerica se legate a membrana, oppure essere secrete con una struttura pentamerica3. Nel caso della struttura pentamerica presentano una catena supplementare J. Sono le prime Ig prodotte dai linfociti B in seguito all’esposizione a un agente infettivo, rappresentano quindi la principale forma di anticorpo nella fase iniziale della risposta immunitaria primaria.

 

Formazione dei recettori per l’antigene


La formazione di geni funzionali codificanti per i recettori per l’antigene dei linfociti B inizia con la ricombinazione somatica dei segmenti genici codificanti per le regioni variabili. Questo processo è alla base della generazione della diversità.

I progenitori linfoidi precoci presentano geni per Ig nella loro configurazione ereditaria (o germinativa), in cui i loci delle catene leggere e pesanti contengono numerosi segmenti genici4 per le regioni variabili (V), e uno o pochi geni per la regione costante (C).

Tra i geni V e C sono presenti numerose brevi sequenze codificanti, chiamate segmenti J (Joining, di collegamento) e D (Diversity, di diversità).

I loci delle catene leggere delle Ig contengono i segmenti V, J e C, mentre solo i loci per le catene pesanti contengono anche i segmenti D.

Quando un progenitore linfocitario è destinato a diventare un linfocita B i segmenti genici vengono ricombinati attraverso una selezione casuale. Nel locus della catena pesante delle Ig inizialmente ricombinano i segmenti D e J, e successivamente il segmento V con l’elemento derivato dalla fusione D-J.

A questo punto nel linfocita B ancora in via di sviluppo si trova l’esone V-D-J, ricombinato nel locus della catena pesante. Il gene V-D-J viene quindi trascritto e unito tramite splicing con un esone C.

Per quanto riguarda la catena leggera, avviene un processo simile dove, tuttavia, mancando i segmenti D si forma direttamente l’esone V-J.

La ricombinazione somatica appena descritta avviene grazie alla ricombinasi VDJ, un enzima espresso esclusivamente nelle cellule linfoidi, e ad altri enzimi coinvolti nella riparazione delle rotture della doppia elica del DNA (ligasi) che sono principalmente non linfocito-specifici.

L’origine della diversificazione dei recettori per l’antigene nei differenti cloni linfocitari deriva in parte dalla ricombinazione casuale dei segmenti genici V, D e J (diversità combinatoriale), ma soprattutto dai cambiamenti introdotti nelle sequenze nucleotidiche a livello delle giunzioni tra i segmenti durante il processo di ricombinazione (diversità giunzionale).

Se la diversità combinatoriale è limitata dal numero dei segmenti genici disponibili, la diversità giunzionale è praticamente illimitata. Durante il processo si producono fisiologicamente tantissimi geni con sequenze che non possono dare origine a proteine e, quindi, privi di utilità;  per questo motivo durante la maturazione linfocitaria vengono attuati diversi punti di controllo, che servono a selezionare e far sopravvivere soltanto le cellule che esprimono recettori utili.

Per racchiudere tutto con alcuni dati, la diversificazione ammonta a circa 105 catene leggere diverse5 che si possono unire a circa 107 catene pesanti diverse6. Nonostante la diversificazione teorica (circa 1012) non venga raggiunta a causa della produzione di geni non funzionali, la diversificazione reale totale risulta essere comunque maggiore di 1010. Questi numeri rappresentano il totale delle combinazioni possibili in un linfocita, ogni clone linfocitario7 produce UNA SOLA di queste combinazioni.

 

Anticorpi Policlonali e Monoclonali


Una popolazione di linfociti identici (ovvero un linfocita e la propria “discendenza”) viene definita clone.

Quando si espone un antigene a un pool di linfociti B naïve si ottiene una risposta policlonale: i molti cloni della popolazione di linfociti B iniziano a produrre anticorpi diretti specificamente verso i molti epitopi differenti che l’antigene presenta, ciascun clone produce un sito di legame per l’antigene diverso.

Gli anticorpi sintetizzati da un singolo clone, invece, vengono definiti monoclonali. Il clone produce sempre lo stesso sito di legame, quindi gli anticorpi prodotti dallo stesso clone legheranno sempre lo stesso epitopo.

Gli anticorpi monoclonali vengono largamente usati in laboratorio in quanto per la loro estrema affinità e specificità di legame sono ottimi reagenti analitici.

La difficoltà maggiore nella produzione di anticorpi in laboratorio consiste nella limitatà capacità di sopravvivenza dei linfociti B in vitro.

Per aggirare questo problema si procede attraverso la fusione di cellule di animale immunizzato contro un antigene (dotate di scarsa capacità di sopravvivenza in vitro), con cellule di mieloma (un tumore delle plasmacellule che può essere propagato indefinitamente). Si effettua successivamente una selezione introducendo in soluzione una sostanza tossica che non può essere metabolizzata dalle cellule di mieloma. In questo modo le cellule tumorali non possono crescere, mentre gli ibridomi (le cellule derivate dalla fusione), contenendo sia il nucleo del mieloma che quello del linfocita B, riescono a produrre gli enzimi necessari al metabolismo di questa sostanza e quindi a svilupparsi.

Attraverso queste due operazioni è possibile crescere selettivamente ibridomi che produrranno una serie di anticorpi policlonali. In seguito si può procedere alla selezione e all’espansione delle cellule che producono gli anticorpi della specificità di interesse (monoclonali), le quali potranno essere mantenute in coltura illimitatamente.

Con questa tecnica è virtualmente possibile produrre anticorpi monoclonali diretti verso qualsiasi antigene, tuttavia, essendo solitamente utilizzati linfociti B di topo fusi con mielomi murini, il loro utilizzo nell’uomo risulta limitato in quanto vengono riconosciuti dal sistema immunitario del ricevente e di conseguenza neutralizzati. Gli anticorpi risultanti da tale fusione sono, infatti, murini a tutti gli effetti.

Il problema è stato superato in diversi modi: uno consiste nel conservare le regioni V (contenenti i CDR) dell’anticorpo monoclonale murino, sostituendo il resto della proteina con un’Ig umana, ma anche in questo caso con l’uso prolungato si può andare incontro a risposte anticorpali anti-Ig.

Più di recente la tecnica del DNA ricombinante ha permesso la produzione di anticorpi monoclonali dalla clonazione del DNA delle Ig umane con la specificità desiderata. Un ulteriore approccio possibile è quello di “umanizzare” il topo sostituendo i geni murini delle Ig con quelli umani e, in seguito, immunizzare questi topi geneticamente modificati in modo che possano produrre anticorpi umani specifici.

Attualmente gli anticorpi monoclonali sono ampiamente utilizzati come molecole terapeutiche e reagenti diagnostici per molte malattie umane.


 

 


1.
La maggior parte degli anticorpi prodotti durante una risposta anticorpale primaria possiede una Kd compresa tra 10-6 e 10-9 M. In seguito a una risposta secondaria (stimolazioni ripetute) la Kd può arrivare a 10-8 – 10-11 M.
2.
Una struttura ripiegata formata da circa 110 amminoacidi.
3.
In questa struttura presenta anche una catena J (di collegamento, da “Joining”).
4.
Circa 100 segmenti.
5.
Circa 2×102 da ricombinazioni, sommando i riarrangiamenti imperfetti e le mutazioni si arriva a più di 105.
6.
Circa 6×103 derivanti dalla ricombinazione, sommando i riarrangiamenti imperfetti e le mutazioni si arriva a circa 106 – 107.
7.
Un linfocita e la propria discendenza, ciascun clone linfocitario produce un’ig unica.

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